Труднее обнаружить, чем ЭПО, генный допинг является менее известным фронтом в борьбе за чистый велосипед
История допинга и борьбы с допингом – это что-то вроде Хитрого Э. Койота, преследующего Дорожного Бегуна: как бы близко Хитрый Э. ни подобрался к Дорожному Бегуну, последний всегда на шаг впереди. Это кажется еще более справедливым для нового, темного уголка допинга, который может звучать как сценарий из научной фантастики, но на самом деле существует уже по крайней мере два десятилетия: генный (или генетический) допинг..
Но, несмотря на быстрое развитие генного допинга, новая методология тестирования генного допинга может стать важным поворотным моментом против использования генов в целях повышения производительности.
ADOPE (Advanced Detection of Performance Enhancement) был представлен в Университете Стерлинга, Шотландия, в начале сентября и является одним из очень немногих известных тестов против генного допинга.
Метод был разработан группой ученых из Технического университета Делфта, Нидерланды, и он будет соревноваться с более чем 300 другими командами на конкурсе генно-инженерных машин 2018 года; Церемония награждения состоится в Бостоне, Массачусетс, 28 октября.
Сначала: что такое генный допинг?
Генетический допинг – это «неправильное использование» генной терапии в целях повышения производительности. Генная терапия, с другой стороны, представляет собой метод, использующий гены, а не лекарства или операции для лечения или предотвращения болезней.
Терапия заключается в доставке внешнего генетического материала в клетки пациента. Генетический материал, который содержит специфическую экспрессию, активирующую белки, используемые для лечения заболевания, встраивается в клетки с помощью внешнего вектора (обычно вируса).
Возьмем, к примеру, ЭПО. Эритропоэтин - белок, стимулирующий выработку эритроцитов в костном мозге и, следовательно, повышающий уровень гемоглобина в организме и доставку кислорода к тканям, - обычно секретируется почками.
Инъекции EPO были печально известным средством повышения производительности, которым велосипедисты злоупотребляли в течение нескольких лет, особенно в 90-х годах.
Сегодня, несмотря на то, что о случаях положительного результата на ЭПО все еще сообщается, становится все труднее избежать наказания за эту практику, поскольку в настоящее время антидопинговый контроль может довольно эффективно обнаруживать внешний ЭПО.
Тем не менее, альтернативный генный допинг, который увеличивает выработку ЭПО за счет введения нового генетического материала в организм спортсмена, в конечном итоге будет выглядеть как естественный продукт собственной физиологии спортсмена, а не как запрещенное вещество.
Хотя генная терапия до сих пор используется только для лечения редких заболеваний, которые не поддаются лечению (таких как тяжелый комбинированный иммунодефицит, слепота, рак и нейродегенеративные заболевания), ученые признались, что к ним обращались люди из мира спорта и просили их использовать эти методы лечения как способ улучшить свои спортивные результаты.
ВАДА и генный допинг
Всемирное антидопинговое агентство (ВАДА) организовало первый семинар для обсуждения генного допинга и связанных с ним угроз в 2002 году, а через год эта практика была внесена в список запрещенных веществ и методов ВАДА.
С тех пор ВАДА выделяет часть своих ресурсов на обнаружение генного допинга (включая создание нескольких групп и комиссий экспертов по генном допингу), а в 2016 году был проведен рутинный тест на генный допинг ЭПО. в аккредитованной ВАДА лаборатории в Австралии, Австралийской лаборатории по тестированию спортивных наркотиков.
Однако методы тестирования на генный допинг могут быть трудоемкими и требуют обширных знаний о конкретной последовательности ДНК для фактической практики тестирования.
Метод, предложенный ADOPE, с другой стороны, фокусируется на целевом секвенировании и сочетает полезные принципы других методов потенциально более эффективным и целенаправленным способом.
Методология тестирования ADOPE
Методология тестирования ADOPE была разработана на основе тестов, проведенных на крови крупного рогатого скота, и состоит из двух фаз: первая фаза представляет собой предварительную фазу скрининга, которая нацелена на потенциально легированную кровью, а вторая нацелена на определенные генетические последовательности для проверить, действительно ли ДНК подверглась генной допингу или нет.
«На предварительном скрининге, - объясняет Джард Маттенс, менеджер по работе с людьми из команды Делфтского технического университета, разработавшей ADOPE, - мы продолжаем использовать так называемые покрытые декстрином наночастицы золота для обнаружения генного допинга.
'Принцип основан на том факте, что наночастицы золота вызывают постепенное количественное изменение цвета образца, когда он содержит "легирующую" ДНК.'
Для того, чтобы работать и тестировать «генно-допированную ДНК» - но без необходимости на самом деле генно-допинговать спортсменов или животных - команда Делфтского технического университета искусственно «добавила» в бычью кровь несколько комплементарных последовательностей ДНК.
Цель их тестов состояла в том, чтобы нацелиться и найти «генно-легированные» последовательности, которые они добавили в кровь.
«Мы используем бычью кровь как хороший заменитель человеческой крови, так как принцип работает точно так же», - объясняет Маттенс.
'Для нашего теста мы добавили несколько типов ДНК в эту бычью кровь в разных концентрациях, чтобы имитировать изменение концентрации с течением времени в соответствии с тем, что мы смоделировали ранее для людей.
'С этого момента наш метод обнаружения будет таким же, и ДНК, которую мы добавили в бычью кровь, должна быть обнаружена нашим методом.'
После того, как кровь с потенциальным генным допингом была идентифицирована из-за изменения ее цвета, следует вторая фаза теста, нацеленная на определенные последовательности, которые были добавлены в кровь.
«Чтобы проверить этот первоначальный скрининг, - продолжает Маттенс, - мы используем технически уникальный и инновационный гибридный белок CRISPR-Cas - Transposase».
'Это можно рассматривать как наномашину, способную специфически обнаруживать специфические различия, присутствующие в генах-допингах ДНК.'
CRISPR, или CRISPR-Cas9 (или редактирование генов), представляет собой другой и более продвинутый метод, который позволяет генетикам использовать две молекулы - фермент под названием Cas9 и фрагмент РНК - для получения изменения (мутация) в ДНК.
Этот метод также был запрещен ВАДА с начала 2018 года как более продвинутый метод генного допинга, но в случае ADOPE метод CRISPR-CAS используется для поиска модифицированной ДНК, а не для ее модификации.
Специфика ADOPE
Модель тестирования, разработанная ADOPE, была специально задумана и разработана для обнаружения гена, который обеспечивает выработку ЭПО в организме человека, но, поскольку методология очень универсальна, исследователи Делфтского технического университета утверждают, что ее можно расширен для обнаружения любого вида генного допинга.'
Основываясь на цикле, в течение которого ЭПО действует в организме, наиболее вероятное время, когда спортсмены будут принимать допинг с использованием этого конкретного гена, будет задолго до соревнований, но в то же время другие гены, нацеленные на другие белки и физиологические улучшения, могут иметь гораздо более быстрый эффект.
Вот почему ADOPE стремится проводить регулярные антидопинговые тесты на протяжении всего тренировочного и гоночного календаря.
Однако, поскольку ожидается, что так называемая «бесклеточная ДНК», на которую нацелены тесты, будет очень мало в моче (хотя присутствует и здесь), в настоящее время ADOPE работает только с образцами крови и ее обнаружением. окно по-прежнему ограничено.
«Основываясь на экспериментальном тесте с нечеловеческими приматами, проведенном Ни и др. в 2011 году, - говорит Маттенс, - мы ожидаем, что окно обнаружения составит всего несколько недель».
'Дальнейшая разработка метода может заставить тот же метод работать и с мочой в будущем'
Разница между ADOPE и другими подходами
«Большинство [других методов тестирования генного допинга] основаны на реакциях, основанных на ПЦР [полимеразная цепная реакция: метод создания копий определенного участка ДНК in vitro], которые имеют много недостатков», - добавляет Маттенс.
'Эти реакции относительно трудоемки и требуют обширных предварительных знаний о последовательности ДНК. Кроме того, использование этих технологий антидопингового тестирования значительно повышает вероятность уклонения от обнаружения».
В качестве альтернативы, некоторые другие методы тестирования сосредоточены на всей последовательности генома; то есть весь генетический материал, присутствующий в клетке или организме.
Но недостатком этого подхода является то, что необходимо учитывать всю последовательность генома, что отнимает много времени, неэффективно и может рассматриваться как вторжение в частную жизнь спортсменов.
«Наш подход, - говорит Маттенс, - фокусируется на целевом секвенировании, которое дополняет полезные принципы обоих подходов».
'Он использует принцип специфичности ПЦР, однако требует только одного целевого сайта на трансгене (но требует нескольких сайтов для поиска), что значительно снижает вероятность уклонения от обнаружения.
'[ADOPE] использует принцип секвенирования всего генома, но более эффективным и целенаправленным образом, что значительно сокращает объем данных.
'В результате мы считаем целенаправленное секвенирование гораздо лучшим подходом и будущим обнаружения генного допинга'
